Untersuchung der mechanistischen Grundlagen pathogener Varianten des humanen Nukleosom‑Remodelling‑Enzyms INO80
Die Deletion des säugetierspezifischen Chromatin‑Remodellers INO80 führt zu embryonaler Letalität (Min et al., 2013), während Amplifikationen und Mutationen von INO80 in einer Reihe von Erkrankungen, darunter verschiedenen Tumorentitäten, beschrieben wurden (Zhang et al., 2017). Die mechanistischen Grundlagen sowie die pathophysiologische Relevanz dieser INO80‑Varianten sind bislang ungeklärt. In dem vorliegenden Promotionsprojekt soll die mechanistische Basis humaner INO80‑Varianten im genetisch gut manipulierbaren Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae untersucht werden, um Rückschlüsse auf ihre potenzielle Rolle in humanen Erkrankungen zu ermöglichen. Es ist zu erwarten, dass Mutationen innerhalb der konservierten ATPase‑Domäne überwiegend zu Loss‑of‑Function‑Phänotypen führen, wohingegen Veränderungen in regulatorischen Regionen die genomische Positionierungspräferenz von INO80 für Nukleosomen modulieren könnten.
Stand der Forschung:
Der evolutionär hochkonservierte, ATP‑abhängige Chromatin‑Remodeller‑Komplex INO80, ursprünglich in Hefe identifiziert, ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, darunter die Transkriptionsregulation, die DNA‑Replikation sowie die DNA‑Reparatur. Mutationen im humanen INO80‑Komplex wurden in unterschiedlichen Tumorentitäten beschrieben, unter anderem im diffus großzelligen B‑Zell‑Lymphom (DLBCL), im hepatosplenischen T‑Zell‑Lymphom (HSTL) sowie in einigen soliden Tumoren (Dominguez‑Sola et al., 2025). Die Rolle von INO80 in der Tumorentstehung und ‑progression ist jedoch bislang nicht geklärt.
Die funktionelle Analyse von INO80 in vivo ist erst seit Kurzem möglich, nachdem ein genetisches System etabliert wurde, das funktionelle Redundanzen mit verwandten Chromatin‑Remodellern ausschaltet. Im genetisch gut manipulierbaren Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wurde hierfür ein Triple‑Knockout‑Stamm (TKO; Δisw1, Δisw2, Δchd1) generiert, in dem die redundanten Faktoren entfernt wurden, sodass die Funktion von Ino80 isoliert untersucht werden kann. Die Depletion von Ino80 in diesem Stamm (bezeichnet als TKOaa_INO80–) führt zu einem ausgeprägten Wachstumsdefekt sowie zu einer ausgeprägten Hypersensitivität gegenüber verschiedenen Stressoren, darunter erhöhte Temperaturen.
Die Auswirkungen von Defekten in Chromatin‑Remodellern auf die Chromatinarchitektur wurden mittels MNase‑Sequenzierung umfassend charakterisiert (Singh et al., 2021) und zeigen tiefgreifende Veränderungen der nukleosomalen Organisation. So führt das Fehlen von Ino80 zu einer deutlichen Verschiebung des +1‑ und des –1‑Nukleosoms, zu einer Erweiterung der nukleosomenfreien Region über Promotoren sowie zu irregulären Nukleosomenarrays entlang der Genkörper. Diese Befunde verdeutlichen, dass die Kombination aus Wachstumsanalysen und MNase‑Sequenzierung eine robuste Unterscheidung verschiedener Remodelling‑Zustände ermöglicht und somit ein geeignetes Instrumentarium zur funktionellen Kartierung von INO80‑Mutationen darstellt. Sämtliche für das beantragte Forschungsvorhaben relevanten Schlüsselmethoden – einschließlich CRISPR‑basierter gezielter Mutagenese, MNase‑Sequenzierung und Tetradenanalyse – wurden in unserem Labor erfolgreich etabliert (Singh et al., 2021; Singh & Mueller‑Planitz, 2026). Die hierfür erforderlichen Stämme wurden generiert und funktionell validiert. Damit sind die geplanten Untersuchungen innerhalb des vorgesehenen Förderzeitraums realistisch und effizient durchführbar.
Arbeits- und Zeitplan einschließlich des Eigenanteils des/der Kollegiaten/Kollegiatin
Das Projekt ist auf eine Laufzeit von zwölf Monaten ausgelegt und folgt einem klar strukturierten Arbeitsplan, der sowohl die Etablierung des Modellsystems als auch die funktionelle Analyse ausgewählter humaner INO80-Mutationen umfasst. Die Arbeitspakete bauen logisch aufeinander auf und ermöglichen der Doktorandin bzw. dem Doktoranden die Erarbeitung eines eigenständigen, klar abgegrenzten wissenschaftlichen Beitrags.
Arbeitspaket (WP) 1: Konstruktion humanisierter Hefestämme
Das humane INO80-Gen (HsINO80) wird amplifiziert und in einen diploiden TKO‑Stamm eingeführt. Anschließend wird geprüft, ob das resultierende Protein HsIno80 den durch den Verlust des S. cerevisiae‑Gens ScINO80 verursachten Phänotyp komplementieren kann. Dies erfolgt mittels Tetradenanalyse sowie Wachstumsanalysen unter Standard‑ und Stressbedingungen. Parallel dazu werden konservierte Schlüsselregionen von INO80 humanisiert, indem die entsprechenden Domänen von S. cerevisiae durch ihre humanen Gegenstücke ersetzt werden (Paret et al., 2000).
WP 2: Einführung krankheitsassoziierter Mutationen in HsINO80
Die in WP 1 etablierten humanisierten Hefestämme bilden ein ideales System zur Analyse krankheitsassoziierter HsIno80‑Varianten. Zu diesem Zweck werden ausgewählte, in humanen Erkrankungen identifizierte HsINO80-Mutationen mittels CRISPR‑basierter gezielter Mutagenese in die humanisierten Stämme eingeführt. Der Erfolg der Mutagenese sowie das Fehlen sekundärer Mutationen werden durch Sequenzierung validiert. Sollte keiner der in WP 1 generierten humanisierten Stämme den Phänotyp ausreichend komplementieren, werden die krankheitsassoziierten Mutationen direkt an den homologen Positionen des S. cerevisiae‑Gens INO80 eingeführt. Jeder Stamm wird einer grundlegenden funktionellen Charakterisierung unterzogen, einschließlich Wachstumsverhalten, Verdopplungszeitbestimmung sowie Sensitivität gegenüber Replikationsstress (Hydroxyharnstoff) und DNA‑Schadensstress (Zeocin). Diese frühe Phänotypisierung dient der Priorisierung der Mutanten für weiterführende molekulare Analysen.
Arbeitspaket (WP) 3: Detaillierte funktionelle Analyse der Mutanten mittels MNase‑Sequenzierung
Die MNase‑Sequenzierung ermöglicht die Erfassung der Auswirkungen der INO80-Mutationen auf die Nukleosomenpositionierung und damit auf die Chromatinarchitektur. Die gewonnenen Datensätze werden integriert und die Mutationen anhand ihrer chromatinstrukturellen Effekte in funktionelle Kategorien eingeteilt. Das Labor verfügt über umfassende Expertise in der Analyse der INO80‑Funktion mittels MNase‑Seq (Singh et al., 2021; Singh & Mueller‑Planitz, 2026), einschließlich der erforderlichen bioinformatischen Auswertung. Diese wird durch Dr. Mark Boltengagen, PostDoc in unserer Arbeitsgruppe (AG Prof. Müller-Planitz), fachlich unterstützt.
Angaben zur Perspektive des Kollegiaten / der Kollegiatin die Promotionsarbeit als Erstautor/in zu veröffentlichen:
Die im Rahmen des Projekts generierten Datensätze werden für eine Erstautorinnen‑Publikation in anerkannten, international begutachteten Fachzeitschriften aufbereitet.
Wöchentliche Projektbesprechungen mit dem Kollegiaten / der Kollegiatin werden durchgeführt von:
Dr. Karina Kettner und Prof. Dr. Felix Müller-Planitz
Literatur
Zhang S, Zhou B, Wang L, Li P, Bennett BD, Snyder R, Garantziotis S, Fargo DC, Cox AD, Chen L, Hu G. INO80 is required for oncogenic transcription and tumor growth in non-small cell lung cancer. Oncogene. 2017; 36: 1430-1439. doi: 10.1038/onc.2016.311.
Min JN, Tian Y, Xiao Y, Wu L, Li L, Chang S. 2013 The mINO80 chromatin remodeling complex is required for efficient telomere replication and maintenance of genome stability. Cell Res. 23, 1396– 1413. doi: 10.1038/cr.2013.113.
Dominguez-Sola et al. 2025, https://reports.mountsinai.org/article/tisch2025-04-ino80- mutations-and-lymphoma
Singh, A. K., Schauer, T., Pfaller, L., Straub, T., Mueller-Planitz, F. (2021). The biogenesis and function of nucleosome arrays. Nat. Commun., 12: 7011-7026 doi: 10.1038/s41467-021-27285-6.
Singh, A. K., Mueller-Planitz F. (2026) The Ies6 subunit is essential for INO80-mediated nucleosome organization. Sci Rep.; 16: 7466. doi: 10.1038/s41598-026-40504-8.
Paret C, Lode A, Krause-Buchholz U, Rödel G. The P(174)L mutation in the human SCO1 gene affects the assembly of cytochrome c oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 2000; 279(2): 341-7. doi: 10.1006/bbrc.2000.3949.
- Art der Promotion
- Forschungssemester notwendig?
- Finanzierung/Anstellung
- Angeschlossen an ein strukturiertes Promotionsprogramm?
- Zeitplan
- 01.10.26
- Abteilung / Struktureinheit
- ein Dokument mit weiterführenden Informationen
-
CPKD Müller-Planitz.pdf
—
PDF-Dokument,
476 KB
Betreuung
- Erstbetreuung
- weitere Betreuende
Relevante/Repräsentative Publikation mit evtl. Vordaten
Methodik/Aufgaben
- Experimentell
- klinisch
- theoretisch
- statistisch
Bewerbung
- Bewerber:innen-Profil
- Benötigte Bewerbungsunterlagen