Funktionelle Auswirkungen einer HGS-Mutation auf die CXCR4-Aktivierung und B-Zell-Depletion
Der ESCRT-0-Komplex, bestehend aus HGS (Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) und STAM1/2, bildet die initiale Stufe der ESCRT-Kaskade an frühen Endosomen [1]. HGS verfügt über eine N-terminale FYVE-Domäne zur Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P) -vermittelten Membranrekrutierung, gefolgt von einem Ubiquitin-Interacting Motif (UIM) zur Erkennung ubiquitinierter Cargos und einem PSAP-Motiv zur Rekrutierung von TSG101/ESCRT-I. Die C-terminale Clathrin-Bindedomäne ermöglicht durch die Rekrutierung von Clathrin auf frühe Endosomen den Abbau von Zelloberflächenrezeptoren [2]. HGS bindet gemeinsam mit STAM ubiquitinierte Membranrezeptoren und vermittelt deren Übergabe an ESCRT-I. Die koordinierte Weitergabe im ESCRT-Komplex führt zur Bildung von multivesikulären Körperchen (MVBs) und zur lysosomalen Degradation der Cargos [3, 4]. HGS ist beispielsweise für die Sortierung und den Abbau des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) essenziell [5, 6], reguliert die räumlich-zeitliche Kontrolle des JAK-STAT-Signalwegs nach IFNAR1-Aktivierung durch IFN-α-Stimulation [7] und steuert die ubiquitinabhängige Sortierung des Chemokinrezeptors CXCR4 [8]. Pathologisch ist ESCRT-0/HGS in verschiedenen Erkrankungen von Bedeutung: Die teetering-Mausmutante zeigt frühe Letalität mit schweren Myelinisierungsdefekten und neuromuskulären Defiziten, was die essenzielle Rolle von HGS für die neuronale Integrität aufzeigt [9]. Ein HGS-Knockout bei der Maus beeinträchtigt die lysosomale Degradation des Immunadaptors STING, was zu einer erhöhten Produktion von Typ-I-Interferonen und einer proinflammatorischen Zytokinsekretion führt [10]. Diese Untersuchungen unterstreichen eine zentrale Rolle von HGS/ESCRT-0 bei der Kontrolle der homöostatischen Regulation von Membranrezeptoren und der inflammatorischen Signaltransduktion.
In diesem Projekt soll die Bedeutung von HGS/ESCRT-0 für die Kontrolle der Membranrezeptor-Homöostase und der inflammatorischen Signaltransduktion untersucht werden. Im Fokus steht insbesondere die essenzielle Rolle von CXCR4 bei der Ausbildung einer Immunschwäche. Hierzu werden EBV-transformierte B-Zellen von Patienten mit einer HGS-Mutation und gesunden Kontrollpersonen verwendet.
Es sollen folgende zellbiologische, molekularbiologische und immunologische Techniken erlernt und in den nachfolgenden Experimenten eigenständig angewendet werden:
Techniken:
1. Zellkultur
2. Durchflusszytometrie
3. Western Blot
4. Immunopräzipitation
Experimente:
A) Führt eine gestörte ESCRT-0-Funktion zu einem verminderten Abbau von CXCR4 und somit zu einer verlängerten Signalweiterleitung von CXCR4?
a. Stimulation von EBV-transformierten B-Zellen mit dem spezifischen CXCR4-Liganden CXCL12.
b. Durchflusszytometrische Analyse der Kinetik der CXCR4-Aktivierung in Abhängigkeit einer HGS-Mutation.
c. Funktionelle Validierung der Aktivierung des CXCR4-Signalwegs durch Immunoblotting (Rezeptor-Phosphorylierung, Phosphorylierung von ERK, AKT).
d. Nachweis einer verlängerten Interaktion von HGS und CXCR4 durch Immunopräzipitation.
B) Führt eine gestörte ESCRT-0-Funktion zu einem verstärkten Recycling von CXCR4 nach Stimulation?
a. Stimulation von EBV-transformierten B-Zellen mit dem spezifischen CXCR4-Liganden CXCL12 sowie dem CXCR4-Antagonisten AMD3100.
b. Durchflusszytometrische Analyse der Kinetik des CXCR4-Recyclings.
c. Nachweis der CXCR4-Ubiquitinierung im Western Blot.
C) Führt eine CXCR4-Aktivierung in EBV-transformierten B-Zellen mit einer HGS-Mutation zu einer gestörten Apoptose?
a. Stimulation von EBV-transformierten B-Zellen mit dem spezifischen CXCR4-Liganden CXCL12 sowie dem CXCR4-Antagonisten AMD3100.
b. Bestimmung der Apoptoserate am Durchflusszytometer.
1. Raiborg C, Stenmark H (2009) The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature 458:445–452. https://doi.org/10.1038/nature07961
2. Wenzel EM, Schultz SW, Schink KO, Pedersen NM, Nähse V, Carlson A, Brech A, Stenmark H, Raiborg C (2018) Concerted ESCRT and clathrin recruitment waves define the timing and morphology of intraluminal vesicle formation. Nat Commun 9:2932. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05345-8
3. Brankatschk B, Wichert SP, Johnson SD, Schaad O, Rossner MJ, Gruenberg J (2012) Regulation of the EGF Transcriptional Response by Endocytic Sorting. Sci Signal 5:. https://doi.org/10.1126/scisignal.2002351
4. Szymanska E, Budick-Harmelin N, Miaczynska M (2018) Endosomal “sort” of signaling control: The role of ESCRT machinery in regulation of receptor-mediated signaling pathways. Semin Cell Dev Biol 74:11–20. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.08.012
5. Lloyd TE, Atkinson R, Wu MN, Zhou Y, Pennetta G, Bellen HJ (2002) Hrs Regulates Endosome Membrane Invagination and Tyrosine Kinase Receptor Signaling in Drosophila. Cell 108:261–269. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(02)00611-6
6. Raiborg C, Malerød L, Pedersen NM, Stenmark H (2008) Differential functions of Hrs and ESCRT proteins in endocytic membrane trafficking. Exp Cell Res 314:801–813. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2007.10.014
7. Zanin N, Viaris de Lesegno C, Podkalicka J, Meyer T, Gonzalez Troncoso P, Bun P, Danglot L, Chmiest D, Urbé S, Piehler J, Blouin CM, Lamaze C (2023) STAM and Hrs interact sequentially with IFN-α Receptor to control spatiotemporal JAK–STAT endosomal activation. Nat Cell Biol 25:425–438. https://doi.org/10.1038/s41556-022-01085-6
8. Marchese A, Raiborg C, Santini F, Keen JH, Stenmark H, Benovic JL (2003) The E3 Ubiquitin Ligase AIP4 Mediates Ubiquitination and Sorting of the G Protein-Coupled Receptor CXCR4. Dev Cell 5:709–722. https://doi.org/10.1016/S1534-5807(03)00321-6
9. Watson JA, Bhattacharyya BJ, Vaden JH, Wilson JA, Icyuz M, Howard AD, Phillips E, DeSilva TM, Siegal GP, Bean AJ, King GD, Phillips SE, Miller RJ, Wilson SM (2015) Motor and Sensory Deficits in the teetering Mice Result from Mutation of the ESCRT Component HGS. PLOS Genet 11:e1005290. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005290
10. Balka KR, Venkatraman R, Saunders TL, Shoppee A, Pang ES, Magill Z, Homman‐Ludiye J, Huang C, Lane RM, York HM, Tan P, Schittenhelm RB, Arumugam S, Kile BT, O’Keeffe M, De Nardo D (2023) Termination of STING responses is mediated via ESCRT‐dependent degradation. EMBO J 42:e112712. https://doi.org/10.15252/embj.2022112712
- Art der Promotion
- Forschungssemester notwendig?
- Finanzierung/Anstellung
- Angeschlossen an ein strukturiertes Promotionsprogramm?
- Zeitplan
- 01.10.26
- Abteilung / Struktureinheit
- ein Dokument mit weiterführenden Informationen
Betreuung
- Erstbetreuung
Relevante/Repräsentative Publikation mit evtl. Vordaten
Methodik/Aufgaben
- Experimentell
- klinisch
- theoretisch
- statistisch
Bewerbung
- Benötigte Bewerbungsunterlagen