Etablierung eines ex vivo-Modells zur Analyse der Gefäßkalzifizierung bei peripherer arterieller Verschlusskrankheit (pAVK).
Stand der Forschung/Vorarbeiten
Patienten mit pAVK sind besonders häufig von Gefäßkalzifizierung betroffen. Glatte Gefäßmuskelzellen (SMCs) spielen in diesem Prozess eine zentrale Rolle, da sie die Mineralisierung der extrazellulären Matrix (EZM) fördern und einer phänotypischen Veränderung unterliegen. Zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen haben wir die Isolation primärer SMCs aus der nicht erkrankten und kalzifizierten Femoralarterie etabliert. Die Kultivierung der Zellen in einem pro-kalzifizierenden Medium führte zu einer Mineralisierung der EZM. In weiteren Studien können wir zeigen, dass die Kalzifizierung gezielt gehemmt werden kann1, 2. Ergänzend verfügen unsere Arbeitsgruppen über etablierte histopathologische3 und bildgebende Verfahren zum Nachweis der Kalzifizierung mittels Zwei-Photonen-Bildgebung und µ-CT. Aufbauend auf diesen Vorarbeiten sollen zwei weiterführende Ansätze etabliert werden: (1) 3D-Kulturen von SMCs in Kollagengelen zur Analyse der räumlichen Organisation und Matrixmineralisierung sowie (2) ein ex vivo-Ansatz mit Gefäßschnitten, der die strukturelle Integrität der nativen Gefäßwand erhält und die Untersuchung der Kalzifikation unter physiologisch näheren Bedingungen ermöglicht. Beide Ansätze überbrücken die Lücke zwischen isolierten 2D-Zellkulturen und translationalen Ansätzen. Dieses Projekt dient dem 3R-Prinzip (Replace, Reduce, Refine), indem in zukünftigen Projekten Tierexperimente reduziert bzw. ersetzt und zugleich die Analyse der vaskulären Kalzifikation bei der humanen Erkrankung verbessert werden.
Hypothese/Fragestellung
Die vaskuläre Kalzifikation bei pAVK kann in 3D-Kulturen primärer glatter Gefäßmuskelzellen sowie in ex vivo-Gewebeschnitten reproduziert und gezielt moduliert werden. Dadurch lässt sich eine tierfreie Modellplattform für die Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen und die Entwicklung neuer Therapieansätze etablieren.
Arbeits- und Zeitplan einschließlich des Eigenanteils
1. Etablierung der ex vivo-Kalzifizierung von Schnitten der A. femoralis (Monat 1-6)
Intraoperativ gewonnene, nicht verkalkte Segmente der A. femoralis werden in Schnitte mit einer Fläche von 3-5 mm² unterteilt und für 14 und 21 Tage in pro-kalzifizierendem Medium kultiviert. Die Vitalität der Gefäße wird mittels Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Freisetzung untersucht. Anschließend erfolgen die Visualisierung und Quantifizierung der Mineralablagerung mittels µ-CT (Prof. Dr. Martina Rauner) sowie der IVISense Osteo 680 Fluorescent Probe und Zwei-Photonen-Bildgebung (Prof. Dr. Stephan Speier). Nach Fixierung der Segmente werden die Mineralakkumulation und die Struktur des Bindegewebes histologisch mittels von-Kossa- bzw. Picrosirius-Rot-Färbung bestimmt. Geplant ist die Analyse von n=10 Spendern, ohne Typ 2 Diabetes mellitus und chronische Nierenerkrankung, sodass krankheitsspezifische Unterschiede die Etablierung nicht beeinflussen. Die Ergebnisse werden mit der Histomorphologie der arteriosklerotischen Plaques der jeweiligen Patienten assoziiert.
2. Etablierung der Kalzifizierung von 3D-SMC-Kulturen aus der Femoralarterie (Monat 1-4)
Die aus der Femoralarterie isolierten SMCs (Zellen von n=6 Spendern sind vorhanden) werden in eine 3D-Kollagenmatrix (PureCol) eingebettet, um die Struktur und Funktion der EZM zu simulieren. Die 3D-Kulturen werden 14 d mit dem pro-kalzifizierendem Medium kultiviert. Anschließend werden Mineralablagerungen mittels IVISense Osteo 680 Fluorescent Probe und Zwei-Photonen-Mikroskopie analysiert. Die Zellmorphologie wird durch Färbung mit Phalloidin und α-SMA und konfokaler Mikroskopie untersucht. Zur Analyse molekularer Veränderungen werden die Zellen aus der Kollagenmatrix extrahiert, RNA und Proteine isoliert und die Expression osteochondrogener SMC-Marker (OPN, ALPL, RUNX2) mittels qPCR und Western Blot bestimmt.
3. Validierung der Modellsysteme durch Hemmung der Kalzifizierung (Monat 5-7)
Wir konnten zeigen, dass die gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP) für die SMC-Kalzifizierung essenziell ist1, 4, 5. Daher erfolgt die funktionelle Validierung der unter 1. und 2. beschriebenen Modelle durch pharmakologische Hemmung von TNAP mittels MLS-0038949 (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Das pro-kalzifizierende Medium der 3D-Zellkulturen bzw. Gewebeschnitte wird mit 10 µM MLS-0038949 supplementiert, wobei DMSO als Lösungsmittelkontrolle dient. Anschließend werden die unter 1. und 2. genannten Analysen zur Bestimmung der Mineralisation durchgeführt. Eine signifikante Reduktion der Calciumablagerungen dient als funktioneller Nachweis der Validität der etablierten Modellsysteme.
4. Untersuchung der ex vivo-Gefäßkalzifizierung bei Typ 2 Diabetes mellitus (T2DM) und chronischer Nierenerkrankung (CKD) (Monat 7-12)
Zusätzlich werden n=6 Gefäßschnitte von Patienten mit T2DM und CKD, zwei häufigen Komorbiditäten, mit den genannten Methoden untersucht, um zu analysieren, ob diese Erkrankungen das Kalzifikationspotenzial der Gefäße ex vivo beeinflussen.
Die tägliche Betreuung wird durch naturwissenschaftliche Mitarbeitende und technischen Mitarbeitenden der beiden Arbeitsgruppen sichergestellt. Verantwortliche gemeinsame Betreuerinnen: PD Dr. rer. nat. Anja Hofman und Prof. Dr. Claudia Göttsch
- Art der Promotion
- Forschungssemester notwendig?
- Finanzierung/Anstellung
- Angeschlossen an ein strukturiertes Promotionsprogramm?
- Zeitplan
- 01.10.26
- Abteilung / Struktureinheit
- ein Dokument mit weiterführenden Informationen
Betreuung
- Erstbetreuung
- weitere Betreuende
Relevante/Repräsentative Publikation mit evtl. Vordaten
Methodik/Aufgaben
- Experimentell
- klinisch
- theoretisch
- statistisch
Bewerbung
- Bewerber:innen-Profil
- Benötigte Bewerbungsunterlagen